近年来，源自诱导多能干细胞的类器官为研究人体器官发育提供了模型。据报道，单细胞转录组学可以对这些系统中的细胞状态提供高度分析。然而，此前还没有办法直接衡量血统关系。
基于此，浙江大学校友何志松及其同事共同开发了谱系记录仪iTracer，它将报告条形码与可诱导的CRISPRCas9疤痕相结合，并兼容单细胞和空间转录组学，可以探索大脑过程中的克隆性和谱系动态。类器官发育。
详细而言，记录器允许从初始化的iPSC 库进行克隆跟踪，以及使用诱导疤痕在不同时间点进行谱系记录，从而允许克隆分析和探索细胞命运建立的时间动态，从而避免了许多轮式的低效率问题。诱导疤痕标记。
2021年12月30日，题为《人脑类器官中的谱系记录》（Lineagerecordingin humancereborgoids）的相关论文发表在NatureMethods上[1]。
长期以来，何志松课题组对人类早期胚胎发育过程中的中枢神经系统特别是大脑发育、神经发育相关疾病的发病机制及其发育表现产生了浓厚的兴趣。
在研究中，他们利用脑类器官微三维组织培养技术，诱导人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化为不同类型的脑神经元和其他细胞类型，从而模拟人脑的早期发育过程。和机制研究。
为了全面描述这一过程中细胞分子特征的变化，他们大量利用单细胞测序技术，特别是单细胞转录组技术，获取期间可能发生的动态细胞状态，并通过整合样本不同时间点的数据，并采用各种计算分析方法来推断不同细胞类型的发生过程。
然而，这种方法也有局限性。目前的单细胞测序技术需要对细胞进行破坏性测量，因此只能获得最终测量时细胞状态的单个快照。
这样就无法得知细胞的历史状态，更无法得知细胞的谱系信息，这意味着这些细胞系是同一干细胞在特定时间分裂分化产生的后代细胞。
这些信息对于更好地绘制早期大脑发育图至关重要。为此，何志松和同事需要一种与当前单细胞测序技术兼容、能够进一步获取细胞谱系信息的新技术，即细胞谱系追踪。
目前，兼容单细胞转录组测序的细胞谱系追踪技术主要分为两类：
一类是静态序列标记，涉及构建高度复杂的条形码序列库，转染并整合到干细胞中，以标记不同的干细胞；
另一类是基于CRISPR技术的动态序列标签，通过诱导CRISPR编辑系统在特定序列上引入一系列随机突变，通过在每个干细胞中检测到的突变组合来构建细胞谱系信息。
两种技术各有优缺点：静态序列标签只能获取单个时间点的谱系信息；基于CRISPR技术的动态标签存在严重的标签冲突问题，多个独立的编辑事件会产生相同的突变，从而导致重建的谱系信息不准确。
为了更好地解决这一问题，何志松和他的同事将这两类技术进行了整合，开发了iTracer技术。 iTracer包含可用于在起始时间点标记不同干细胞的静态序列标签，以及基于CRISPR编辑系统的动态序列标签。与具有可诱导Cas9蛋白基因的干细胞相结合，可以在特定时间点生成额外的随机序列。突变以获得第二层细胞谱系信息。
综上所述，该技术综合了两类现有技术的优点。它不仅可以获取多个时间点的谱系级信息，还可以减少标记冲突的影响。
然后，他们在大脑类器官系统中使用iTracer 技术来研究大脑类器官中不同类型神经元之间的谱系连接。
他发现代表不同大脑区域的神经元往往是由不同的多能干细胞产生的，而同一多能干细胞产生的子代细胞在空间分布上表现出聚集的分布特征。
这一现象暗示，在分裂和分化的过程中，脑类器官的细胞并没有发生明显的细胞迁移，因此它们的子代细胞呈簇状分布，并在相似的微环境下被诱导成相同类型的神经元。
使用长期光片显微镜对稀疏核标记的脑类器官进行的后续观察进一步支持了这一假设。
在此基础上，通过引入不同时间点的动态序列标记，我们还可以获得脑类器官中不同细胞类型，特别是不同类型神经元命运决定的关键时间点，并分析同一多能干细胞的不同作用。比较后代神经元的分化。
此外，通过在iTracer的基础上额外引入针对目的基因的gRNA，可以利用iTracer记录细胞谱系信息，同时基于CRISPR技术对目的基因进行基因敲除，进而敲除相应的基因。如何影响细胞谱系的发育和分化。
据报道，何志松和同事还将iTracer-perturb技术应用于脑类器官，对TSC2基因对脑类器官神经元发育的影响进行了初步研究。
结合基于CRISPR技术的iTracer技术进行基因敲除
该研究始于2017年，何志松课题组主要关注的生物系统一般与组织发育、组织再生、干细胞分化等相关，其中包含大量细胞状态的动态转变。
因此，当时逐渐成熟的大规模单细胞转录组测序技术让他能够研究这些动态过程。然而，由于单细胞测序技术对被测细胞具有破坏性，如何通过实验手段直接获取不同细胞之间的谱系关系，成为何志松和同事们急于解决的问题。
当时，静态序列标记技术CellTag，包括华盛顿大学遗传与发育生物学系教授Sam Morris和柏林医学系统生物学研究所（BIMSB）的Jan Philipp Junker团队组成德国团队的动态序列标记技术LINNAEUS刚刚兴起。
它们都是与单细胞转录组测序技术兼容的细胞谱系追踪技术，何志松研究团队也已经开始使用。但随后，他们很快发现了上述技术的局限性，因此他们想开发一种能够将静态序列标签和动态序列标签结合起来的方法。
这个想法成为一个项目，并于2018年正式启动。他们首先构建了含有iTracer元件的转座子质粒载体，并开始在脑类器官中使用批量测序来证明iTracer技术的可行性。
在确定该技术可行后，他们从2019年开始在脑类器官系统中使用iTracer技术，从而获得不同时间点动态序列标记诱导的脑类器官的单细胞转录组测序数据并进行数据分析。
2020年初，迎来了数据分析的初步结果，何志松从中了解到，多能干细胞在分裂、分化、产生脑类器官的过程中并没有明显的迁移。基于此，他假设同一谱系的细胞在空间中聚集在一起。
为了证明这一假设的合理性，一方面，他和研究团队其他成员将iTracer技术与空间转录组相结合，观察脑类器官中不同细胞谱系的分布；另一方面，他们还利用长期光片显微镜技术记录了大脑类器官的早期发育，并追踪了几种细胞核被标记的干细胞及其后代。
两种方法都验证了上述假设。然后，通过比较不同时间点引入的动态序列标签的样本，何志松推断了脑类器官中不同神经元命运的重要时间点，并生成了相应时间的脑类器官的单细胞转录组数据。确认此时存在不同的神经祖细胞。
考虑到此次使用的是10x Genomics的单细胞测序技术，实际上只测量了每个大脑类器官中的极少数细胞。这导致每个细胞谱系只能获得几个细胞的数据，并且也限制了每个细胞谱系获取数据的能力。使得直接比较变得困难。
为此，研究团队还对单个类器官进行了显微解剖，并对所得的每个部分进行了深入的单细胞转录组测序，从而实现了细胞谱系的充分采样。
最后，他们扩展了iTracer技术，在原有的iTracer载体的基础上引入了针对目标敲除基因的gRNA，从而将其与基于CRISPR技术的基因敲除相结合。
这促使他们对由此产生的iTracer-perturb 技术进行了初步应用，并研究了TSC2 基因在大脑类器官发育中的作用，以及对细胞谱系的潜在影响。
（来源：自然方法）
可用于所有体外细胞培养系统
研究中还发生过一个小插曲。何志松说：不同神经元富集不同多能干细胞谱系的结果一开始是出乎意料的。因为我们认为用于培养大脑类器官的多能干细胞是一致的，所以很自然地预期不同的干细胞同样可能产生各种类型的神经元。
因此，他当时的第一反应就是分析方法可能有问题，或者由于某种原因不同的干细胞确实有产生不同神经元的倾向。
直到一次讨论，他才恍然大悟，这个结果其实可以用干细胞迁移率低导致的细胞谱系分布不均匀，以及不同神经元空间分布不均匀来解释。
为了进一步证实这个想法，他设计了将iTracer与空间转录组学和长期光片显微镜相结合的实验，这些实验最终证实了上述想法。
谈到潜在的应用，他表示：目前这项技术的应用应该停留在基础研究领域，但绝不限于大脑类器官系统。理论上，iTracer技术可以用于所有体外细胞培养系统，唯一的要求是所使用的干细胞必须具有可诱导的CRISPR编辑系统。
出生于广东，本科就读于浙江大学生命学院
何志松，广东中山人，1987年出生，就读于浙江大学生命科学学院生物信息学专业。 2009年被推荐至中国科学院上海生命科学研究院马克斯·普朗克学会伙伴计算生物学研究所，师从Philipp Khaitovich研究员。
2015年博士毕业后，继续在课题组工作至2017年。在中科院期间，何志松以第一作者或通讯作者在《自然神经科学》《分子精神病学》等期刊发表多篇论文。
2018年，他来到德国莱比锡马克斯·普朗克进化人类学研究所，加入Barbara Treutlein教授的单细胞基因组学研究组进行博士后研究。
2019年，他随团队转到瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系，在Truitling团队继续博士后工作。
在此期间，何志松的研究方向是单细胞功能基因组学，特别是单细胞转录组数据的分析和方法开发。他还利用大脑类器官和其他类器官系统作为模型来研究早期人类大脑和其他器官的发育。细胞命运决定机制。
来瑞士后，他以第一作者或通讯作者身份在Nature、Genome Biology、Stem Cell Report等杂志上发表论文。
2021年7月，何志松成为团队高级研究助理。在科学研究的基础上，他开始负责计算资源管理和一些学生指导。
对于本文的后续研究，他表示：我们正在组内其他几项研究中使用iTracer技术，并取得了很好的效果。同时，我们也希望进一步完善iTracer，主要研究CRISPR系统在引入动态序列标记方面效率较低的问题。
-结尾-
